Sondas de metila em proteínas para determinar o modo de ligação do ligante em proteínas fracas

Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 11231 (2022) Citar este artigo

1067 acessos

1 Citações

13 Altmétrica

Detalhes das métricas

As estruturas dos complexos proteína-ligante fornecem informações críticas para o planejamento de medicamentos. A maioria das estruturas complexas proteína-ligante é determinada usando cristalografia de raios-X, mas onde a cristalografia não é capaz de gerar uma estrutura para um complexo, a RMN é frequentemente a melhor alternativa. No entanto, as ferramentas disponíveis para permitir a determinação rápida e robusta da estrutura de complexos proteína-ligante por RMN são atualmente limitadas. Isso leva a situações em que os projetos são descontinuados ou executados sem dados estruturais, tornando a tarefa mais difícil. Relatamos anteriormente a abordagem de substituição molecular de NMR (NMR2) que permite que a estrutura de um complexo proteína-ligante seja determinada sem exigir a tarefa incômoda de atribuição de ressonância de proteína. Aqui, descrevemos a abordagem NMR2 para determinar a pose de ligação de uma pequena molécula em um complexo proteína-ligante fraco coletando NOEs de metil para ligante de proteína esparsa de uma amostra de proteína marcada seletivamente e um ligante não marcado. No esquema de marcação seletiva, todos os resíduos contendo metila da proteína são protonados em um fundo deuterado. Isso permite a medição de NOEs intermoleculares com maior sensibilidade usando sequências de pulso NOESY padrão em vez de experimentos de NMR filtrados por isótopos. Essa abordagem de rotulagem é adequada para a abordagem de NMR2 e estende sua utilidade para incluir complexos proteína-ligante maiores.

O design de drogas baseado em estrutura provou ser muito eficiente no processo de otimização hit to lead1. A cristalografia de raios X é a técnica preferida para gerar dados estruturais2. Embora a cristalização geralmente funcione bem para ligantes de alta afinidade, aqueles que se ligam fracamente podem ser mais desafiadores. Quando o complexo não cristaliza, a RMN pode fornecer uma abordagem alternativa para gerar dados estruturais. No entanto, o tempo necessário para gerar uma estrutura por RMN costuma ser muito longo para projetos de química medicinal. Nos últimos anos, vários métodos de RMN foram desenvolvidos para relatar o modo de ligação do ligante3. Perturbação de deslocamento químico (CSP)4,5,6,7, transferência de saturação8, atribuição de ressonância NMR parcial9 e abordagens de deslocamento de pseudocontato10,11 são alguns métodos que abordam esse problema12,13,14. Relatamos anteriormente um método para derivar a estrutura de um sítio de ligação proteína-ligante chamado NMR Molecular Replacement, NMR2. Este método pode gerar estruturas precisas de um sítio de ligação proteína-ligante em poucos dias15,16,17. Nem as atribuições de backbone nem sidechain são necessárias para NMR2. Em vez disso, este método usa NOEs intermoleculares de proteína-ligando semi-ambíguos e NOEs intra-ligando como entradas experimentais em conjunto com um modelo inicial da proteína para calcular a estrutura ligada. Os cálculos de estrutura são baseados em protocolos de NMR padrão e as saídas são classificadas de acordo com a concordância entre a entrada experimental e a estrutura calculada. O NMR2 é um método sistemático e, conseqüentemente, não contém nenhum componente estocástico. Ele também não depende de receitas de ancoragem, mas de uma série de protocolos robustos de cálculo de estrutura. O NMR2 pode ser usado para resolver vários tipos diferentes de estruturas complexas envolvendo ligantes fortes e fracos, pequenas moléculas, peptídeos e peptidomiméticos15,16,17. O método também é capaz de detectar bolsas de encadernação crípticas15,16,17. Aqui detalhamos o uso de NMR2 em conjunto com esquemas de rotulagem de metila específicos em um fundo deuterado (ver Suplementar Fig. S1). A vantagem de esquemas específicos de rotulagem de metil em proteína NMR, onde os grupos metil são protonados em um fundo deuterado, permite que sistemas de peso molecular muito mais alto sejam estudados devido às propriedades de relaxamento favoráveis ​​dos grupos metil18,19. Além disso, a rotulagem estereoespecífica de grupos metil é possível, o que reduz a ambigüidade das atribuições de ressonância de proteínas.