Projeto racional de uma sensibilidade

Nature Communications volume 13, Número do artigo: 4961 (2022) Citar este artigo

2333 Acessos

1 Altmétrica

Detalhes das métricas

A polipose adenomatosa coli (APC)-Rho guanina nucleotide exchange factor 4 (Asef) interação proteína-proteína (PPI) é essencial para a metástase do câncer colorretal, tornando-se um alvo promissor de drogas. Aqui, obtemos um rastreador de sensibilidade aprimorada (traçador 7) com uma alta afinidade de ligação (Kd = 0,078 μM) e ampla faixa dinâmica de sinal (span = 251 mp). Usando o tracer 7 em ensaios de polarização de fluorescência para triagem do inibidor APC-Asef, descobrimos um inibidor de primeira classe, MAI-516, com um IC50 de 0,041 ± 0,004 μM e uma sequência de transativação transcricional conjugada para gerar MAIT permeável à célula -516. O MAIT-516 inibe a migração de células CRC impedindo especificamente o APC-Asef PPI. Além disso, o MAIT-516 não apresenta efeitos citotóxicos nas células epiteliais intestinais normais e no crescimento de células de câncer colorretal. No geral, desenvolvemos um rastreador de sensibilidade aprimorada para ensaios de polarização de fluorescência, que é usado para a quantificação precisa de inibidores de APC-Asef de alta atividade, fornecendo assim informações sobre o desenvolvimento de medicamentos PPI.

As interações proteína-proteína (IBPs) desempenham um papel fundamental em praticamente todos os processos biológicos e são consideradas o "santo graal" da ciência da vida e da medicina modernas1,2,3,4. A manipulação de IBP tem imenso potencial para o desenvolvimento de medicamentos e, portanto, os IBP estão emergindo como alvos importantes para o tratamento farmacêutico de doenças humanas. Devido às características relativamente grandes, planas e sem características conformacionais das interfaces de PPI, o direcionamento de PPI por inibidores de moléculas pequenas é um desafio na descoberta de medicamentos, e os PPIs são frequentemente considerados "não drogáveis". Como alternativa, o desenvolvimento de peptídeos baseados em motivos ou inibidores peptidomiméticos, que mimetizam estruturas secundárias críticas, ou seja, os "pontos críticos" nas interfaces de PPI, fornece uma estratégia eficiente para drogar PPIs5,6,7.

A polipose adenomatosa coli (APC)–Rho guanina nucleotide exchange factor 4 (Asef) PPI representa um dos exemplos por excelência do desenho racional de peptídeos terapêuticos ou inibidores peptidomiméticos para implicações clínicas. A APC é responsável por várias vias de sinalização por meio de várias interações proteicas. Comumente, a APC promove a degradação da β-catenina e, assim, regula negativamente a sinalização de Wnt. Na metástase do câncer colorretal (CRC), foram observadas alterações do gene APC para gerar proteínas APC truncadas C-terminal, que causaram a perda dos domínios necessários para a ligação de β-catenina, mas aumentaram a ativação de Asef através do domínio APC-ARM. A atividade do fator de troca de nucleotídeos de guanina (GEF) Asef ativado constitutivamente pela ligação APC-ARM promoveu a migração de células CRC via pequena sinalização de GTPase tipo Rho8,9,10,11,12,13. Essas características sugerem que o IBP APC-Asef é um potencial alvo terapêutico para o tratamento do CCR metastático; além disso, seus inibidores podem ser usados ​​como drogas potenciais para inibir a migração de células CCR.

Para rastrear os inibidores peptídicos e peptidomiméticos do APC–Asef PPI, um ensaio de competição de polarização de fluorescência (FP)14,15 foi desenvolvido em um estudo anterior, em que um peptídeo marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) serviu como um marcador (Ac–176GGGGEQLAINELISDGK [FITC]195–NH2, marcador 1) nos ensaios de FP. Após a triagem de uma série de peptídeos truncados com base nos resíduos Asef 176–194, encontramos um hit inibidor, MAI-005 (181GGEQLAI187), da interação APC–Asef PPI16. Em seguida, otimizamos o MAI-005 em dois inibidores peptidomiméticos, MAI-203 e MAI-40016,17. Para auxiliar na translocação de inibidores peptidomiméticos através das membranas plasmáticas de células de mamíferos, conjugamos MAI-203 com uma sequência de transativação transcricional (TAT) e produzimos MAIT-203, que inibiu a migração de células CRC interrompendo o APC-Asef PPI16. No entanto, a sensibilidade do ensaio FP dependia das afinidades de ligação dos marcadores FP e proteínas-alvo18,19,20. Traçadores FP com afinidades limitadas geralmente exibem sensibilidades desfavoráveis21,22, o que restringe acentuadamente sua aplicação na triagem de inibidores de PPI altamente ativos23,24. Para nosso sistema APC–Asef PPI, como a afinidade de ligação do traçador atual 1 era limitada (EC50 = 0,54 ± 0,009 µM), o ensaio FP não pôde ser usado para distinguir compostos altamente potentes. Além disso, esse obstáculo também ocorreu em outras otimizações de inibidores de IBP25. Assim, otimizar o traçador e aumentar sua afinidade de ligação são cruciais para melhorar a sensibilidade do ensaio FP na triagem de inibidores de PPI.