Caracterização estrutural e funcional do domínio catalítico de uma célula

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 5345 (2023) Citar este artigo

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Polissacarídeos monooxigenases líticos bacterianos (LPMOs) são conhecidos por oxidar os polímeros mais abundantes e recalcitrantes na Natureza, nomeadamente celulose e quitina. O genoma do actinomiceto modelo Streptomyces coelicolor A3(2) codifica sete LPMOs putativos, dos quais, após análise filogenética, quatro se agrupam com LPMOs típicos oxidantes de quitina, dois com LPMOs típicos ativos de celulose e um que se destaca por fazer parte de um subclado de enzimas não caracterizadas. A última enzima, chamada ScLPMO10D, e a maioria das enzimas encontradas neste subclado são únicas, não apenas por causa da variação no domínio catalítico, mas também porque seu C-terminal contém um sinal de classificação da parede celular (CWSS), que sinaliza o LPMO para ancoragem covalente à parede celular. Aqui, produzimos uma versão truncada do ScLPMO10D sem o CWSS e determinamos sua estrutura cristalina, espectro EPR e várias propriedades funcionais. Apesar de mostrar várias características estruturais e funcionais típicas de LPMOs ativos de celulose bacteriana, ScLPMO10D é ativo apenas na quitina. A comparação com dois LPMOs oxidantes de quitina conhecidos de diferentes táxons revelou diferenças funcionais interessantes relacionadas à reatividade do cobre. Este estudo contribui para nossa compreensão dos papéis biológicos dos LPMOs e fornece uma base para a comparação estrutural e funcional de LPMOs filogeneticamente distantes com especificidades de substrato semelhantes.

Streptomyces, o gênero dominante do filo das actinobactérias, são bactérias do solo Gram-positivas e principalmente aeróbicas facultativas que possuem um grande número de genes que codificam enzimas ativas de carboidratos (CAZymes), fornecendo um repertório multifacetado de enzimas para a desconstrução de carboidratos estruturais complexos de alta recalcitrância. Esses carboidratos incluem polissacarídeos da parede celular vegetal, como celulose e xilana, bem como a quitina, esta última encontrada nas paredes celulares de fungos e nos exoesqueletos de espécies de artrópodes (isto é, crustáceos e insetos). O genoma do modelo representativo de Streptomyces coelicolor A3(2) tem mais de 240 genes1 codificadores de CAZyme, incluindo hidrolases glicosídicas (GHs) das famílias 3, 5, 6, 9, 12 e 48 (ou seja, celulases2 típicas), além aos GHs da família 18–20 (ou seja, quitinases típicas). Além disso, S. coelicolor exibe sete genes que codificam monooxigenases de polissacarídeos líticos (LPMOs) que são todos membros da família de atividade auxiliar (AA) 10 (AA10)3,4.

A classe AA foi adicionada recentemente ao banco de dados CAZy e contém enzimas redox-ativas que auxiliam CAZymes na degradação da biomassa5. Atualmente, oito das dezessete famílias AA contêm LPMOs, viz. famílias AA9-11 e AA13-176,7,8,9,10,11,12,13,14. LPMOs são amplamente difundidos na natureza e são mais conhecidos por seu papel sinérgico com glicosídeos hidrolases na conversão de celulose e quitina4,6,7,8,15,16. Enquanto os GHs usam um mecanismo hidrolítico para quebrar ligações glicosídicas de polissacarídeos, os LPMOs usam um único cofator de cobre, que após a redução pode ativar H2O217,18 e possivelmente também O26,19 para gerar uma espécie de oxigênio altamente reativa17,18,20,21 ,22 que é necessário para oxidar o carbono C1 ou C4 na ligação glicosídica cindível. É importante observar que a reação da peroxigenase (com H2O2) é muito mais rápida do que a reação da "monooxigenase" (com O2)18,23,24,25. A ação do LPMO torna o substrato polissacarídeo mais suscetível à ação dos GHs, aumentando assim a eficiência geral do processo de degradação do polissacarídeo.

Os LPMOs fúngicos, ocupando as famílias AA9, 11, 13, 14 e 16, têm atividade para uma variedade de polissacarídeos, incluindo celulose, violo-oligômeros, várias hemiceluloses, quitina e amido7,9,10,13,14. Por outro lado, para LPMOs bacterianos, que dominam a família AA10, foi descrita apenas atividade para celulose ou quitina, ou ambas6,8,26. Além disso, os genes LPMO tendem a ser abundantes em genomas fúngicos, alguns com números chegando a > 3.027, enquanto a maioria dos genomas bacterianos possui apenas um ou dois genes LPMO, com a notável exceção de alguns membros do gênero Streptomyces28. Dois dos sete LPMOs no genoma de S. coelicolor A3(2) (Fig. 1), ScLPMO10B e ScLPMO10C (anteriormente conhecido como CelS2), foram extensivamente estudados e demonstraram ter como alvo substratos celulósicos8,17,26,29. Estudos transcriptômicos recentes revelaram que ScLPMO10E e ScLPMO10G foram significativamente aumentados quando S. coelicolor foi cultivado em quitina como única fonte de carbono, e ScLPMO10G recombinante demonstrou possuir atividade oxidante de quitina30. A análise filogenética mostrou que os dois últimos LPMOs (ou seja, ScLPMO10E e ScLPMO10G) junto com ScLPMO10A e ScLPMO10F agrupam-se com AA10s quitinolíticos conhecidos31,32, enquanto ScLPMO10D agrupa-se em um novo subclado de enzimas não caracterizadas (Fig. 2).