Síntese de sondas fluorescentes de vancomicina que retêm atividade antimicrobiana, identificam Gram

Biologia das Comunicações volume 6, Número do artigo: 409 (2023) Citar este artigo

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A resistência antimicrobiana é uma ameaça urgente à saúde humana, e novas drogas antibacterianas são desesperadamente necessárias, assim como ferramentas de pesquisa para auxiliar em sua descoberta e desenvolvimento. A vancomicina é um antibiótico glicopeptídeo amplamente utilizado para o tratamento de infecções por Gram-positivos, como doenças sistêmicas com risco de vida causadas por Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Aqui demonstramos que a modificação da vancomicina pela introdução de um substituinte azida fornece um intermediário versátil que pode sofrer reação de cicloadição de azida-alcino catalisada por cobre (CuAAC) com vários alcinos para preparar facilmente sondas fluorescentes de vancomicina. Descrevemos a síntese fácil de três sondas que retêm perfis antibacterianos semelhantes ao antibiótico vancomicina parental. Demonstramos a versatilidade dessas sondas para a detecção e visualização de bactérias Gram-positivas por uma variedade de métodos, incluindo quantificação de leitor de placa, análise de citometria de fluxo, imagem de microscopia de alta resolução e análise de microfluídica de célula única. Paralelamente, demonstramos sua utilidade na medição da permeabilização da membrana externa de bactérias Gram-negativas. As sondas são ferramentas úteis que podem facilitar a detecção de infecções e o desenvolvimento de novos antibióticos.

Vancomicina 1, um antibiótico glicopeptídeo, é comumente usado para tratar infecções causadas por bactérias Gram-positivas multirresistentes1. A vancomicina foi introduzida para uso clínico no final da década de 1950, embora o uso generalizado tenha sido adiado por vários anos devido à toxicidade das preparações brutas iniciais2. A vancomicina inibe o crescimento de bactérias ligando-se ao dipeptídeo terminal D-Ala-D-Ala do precursor do peptidoglicano Lipídeo II e evita que o Lipídeo II reaja com transpeptidases (que catalisam a etapa de reticulação) ou transglicosilases (que catalisam a extensão do açúcar cadeias)3. Em comparação com outros antibióticos, a resistência à vancomicina levou muito tempo para se desenvolver, já que se passaram quase 30 anos antes que infecções por enterococos resistentes à vancomicina (VRE) fossem relatadas em meados e no final da década de 19804. A resistência aos antibióticos glicopeptídeos, como encontrada em Enterococci, resulta principalmente da expressão dos agrupamentos de genes de resistência: vanA e vanB. Esses clusters codificam enzimas que produzem um precursor de peptidoglicano modificado D-Ala-D-Lac, em vez de D-Ala-D-Ala, reduzindo a afinidade de ligação dos glicopeptídeos5,6. A vancomicina é geralmente considerada o tratamento de primeira linha para infecções sistêmicas graves por Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA)7. No entanto, a suscetibilidade reduzida de MRSA a antibióticos glicopeptídeos, conhecidos como glicopeptídeo intermediário S. aureus (GISA) (concentração inibitória mínima de vancomicina (MIC) = 4–8 µg/mL em comparação com MIC ≤ 2 µg/mL para cepas suscetíveis), foi observado pela primeira vez no Japão em 19968. As cepas GISA possuem uma parede celular mais espessa em comparação com as cepas susceptíveis a glicopeptídeos. Essa parede celular espessada aumenta o número de sítios de ligação 'chamariz' para glicopeptídeos, levando ao aprisionamento de moléculas de glicopeptídeos de modo que menos moléculas de glicopeptídeos possam atingir o local alvo na membrana citoplasmática2,9. O primeiro caso de S. aureus resistente à vancomicina (VRSA) foi relatado em 2002 (vancomicina MIC ≥ 16 µg/mL), usando a mesma modificação Lipid II como VRE10,11, embora felizmente poucos casos de VRSA tenham sido relatados até agora. No geral, dada a crescente prevalência de cepas GISA e VRE, a eficácia da vancomicina para tratar doenças infecciosas bacterianas Gram-positivas está ameaçada2.

As tecnologias usadas para visualizar a estrutura celular e a dinâmica em células vivas permitem que os cientistas entendam a interação e a função de biomoléculas em sistemas biológicos complexos. Em particular, entender a complexidade celular das bactérias e como os antibióticos interagem com as bactérias é importante no desenvolvimento de novas estratégias para combater bactérias resistentes a antibióticos. Um dos pilares dos ensaios bacterianos que avaliam os mecanismos de ensaio de antibióticos, particularmente para aqueles ativos contra bactérias Gram-negativas, são os corantes fluorescentes que avaliam os danos à membrana. A N-fenil-1-naftilamina (NPN) é uma sonda lipofílica não carregada com baixo rendimento quântico de fluorescência em um ambiente aquoso, que se torna fluorescente quando particionada no ambiente hidrofóbico de uma membrana lipídica. É amplamente utilizado para avaliar danos à membrana externa (MO) de bactérias Gram-negativas, que normalmente impedem a penetração de NPN12, mas se enfraquecido permite a intercalação de NPN no folheto interno do fosfolipídio OM e na membrana citoplasmática, causando aumento da fluorescência. O NPN é frequentemente usado em combinação com corantes que coram os ácidos nucléicos das células, como SYTOX® Green, que é impermeável às células vivas, sendo a coloração indicativa de danos nas membranas externa e interna13. O iodeto de propídio (PI) é outro indicador de células mortas impermeabilizadas por células que exibe fluorescência aumentada após ligação ao DNA ou RNA, e agora é amplamente usado para detectar células mortas dentro de uma população de bactérias14.